Dulliau ymchwil biolegol moleciwlaidd a'u defnydd

biolegol moleciwlaidd ddulliau ymchwil yn chwarae rhan bwysig mewn meddygaeth fodern, gwyddoniaeth fforensig, a bioleg. Diolch i ddatblygiadau yn yr astudiaeth o DNA ac RNA, mae'r person yn gallu archwilio genom yr organeb benderfynu ar y cyfrwng achosol, i gydnabod y asid niwclëig a ddymunir mewn cymysgedd o asidau, etc.

Dulliau Moleciwlaidd-biolegol. Beth yw e?

Yn ôl yn y 70-80s y gwyddonwyr oedd y cyntaf i ddehongli y genom dynol. Rhoddodd y digwyddiad hwn hwb i ddatblygiad peirianneg genetig a bioleg moleciwlaidd. Astudio priodweddau DNA ac RNA wedi golygu ei bod bellach yn bosibl defnyddio asidau niwclëig hyn at ddibenion diagnosis clefydau, genyn astudio.

Paratoi DNA ac RNA

biolegol moleciwlaidd dulliau diagnostig yn ofynnol gan ddechrau deunydd: yn aml mae hyn asid niwclëig. Mae sawl ffordd i ddewis sylweddau hyn o'r celloedd organebau byw. Mae gan bob un ei fanteision ac anfanteision, a dylid ei hystyried wrth ddewis dull o ynysu asidau niwclëig mewn ffurf pur.

1. Paratoi DNA gan Marmur. Mae'r dull yn cynnwys wrth drin y cymysgedd o sylweddau alcohol, dyddodi arwain DNA pur. Yr anfantais y dull hwn yw y defnydd o sylweddau cyrydol, ffenol a clorofform.

2. Ynysu DNA ar y ffyniant. Y prif sylwedd a ddefnyddir yma - yn thiocyanate guanidine (GuSCN). Mae'n hyrwyddo dyddodi asid diocsiriboniwclëig ar swbstradau arbenigol, o ble gellir ei gasglu ar ôl hynny drwy gyfrwng clustog arbennig. Fodd bynnag GuSCN - yn atalydd o'r TCP, a hyd yn oed rhan fach o hynny yn cael ei adneuwyd mewn DNA yn gallu dylanwadu ar y cwrs yr adwaith cadwyn polymeras, sy'n bwysig wrth weithio gyda asidau niwclëig.

3. Gwaddodiad o amhureddau. Mae'r dull yn wahanol i rhai blaenorol gan fod y moleciwlau eu hunain yn cael eu hadneuo asid dehoksiribonukleinovoy a amhureddau. I wneud hyn, defnyddiwch y cyfnewidwyr ion. Yr anfantais yw y gall nid yw pob sylwedd setlo.

4. sgrinio Offeren. Mae'r dull hwn yn cael ei ddefnyddio mewn achosion pan nad oes angen i chi gael gwybodaeth gywir am adeiledd y moleciwl DNA, a'r angen i gael rhywfaint o ystadegau. Y rheswm yw y gall y strwythur asid niwclëig yn cael eu difrodi wrth drin glanedyddion, yn enwedig alkalies.

Dosbarthiad o ddulliau ymchwil

Mae pob dull moleciwlaidd-biolegol ymchwil yn cael eu rhannu yn dri grŵp o bwys:

1. Helaethiad (gan ddefnyddio lluosogrwydd o ensymau). Mae hyn yn cynnwys PCR - adwaith cadwyn polymeras, sy'n chwarae rhan bwysig mewn llawer o'r dulliau diagnostig.

2. Neamplifikatsionnye. Mae'r grŵp hwn o ddulliau yn gysylltiedig yn uniongyrchol â gwaith cymysgeddau asid niwclëig. Enghreifftiau yw 3 math blots, yn hybrideiddio fan a'r lle, ac yn y blaen

3. Dulliau sy'n seiliedig ar gydnabod y signal o'r moleciwl probe, sy'n clymu ynghyd â DNA neu RNA chwiliedydd penodol. Enghraifft - system hybrideiddio ateb System Capture Hybride (HC2).

Ensymau y gellir eu defnyddio mewn dulliau ymchwil biolegol moleciwlaidd

Mae llawer o dechnegau diagnostig moleciwlaidd cynnwys defnyddio ystod eang o ensymau. Isod yn cael eu defnyddio fwyaf aml:

1. cyfyngiad ensymau - "torri" y moleciwl DNA i rannau angenrheidiol.

2. polymeras DNA - synthesizes moleciwl asid diocsiriboniwclëig dwbl-sownd.

3. transcriptase Reverse (transgriptas gwrthdro) - a ddefnyddir i syntheseiddio DNA o templed RNA.

4. DNA ligas - sy'n gyfrifol am ffurfio bondiau phosphodiester rhwng niwcleotidau.

5. exonuclease - cael gwared ar niwcleotidau o dogn ddiwedd y moleciwl asid diocsiriboniwclëig.

PCR - y dull sylfaenol o DNA ymhelaethu

adwaith cadwyn polymeras (PCR) yn cael ei defnyddio'n eang mewn bioleg foleciwlaidd fodern. Mae'r dull hwn, lle gall moleciwl DNA unigol gael nifer fawr o gopïau (moleciwl ymhelaethu).

Prif swyddogaethau'r PCR:

- diagnosis o glefydau;

- clonio segmentau DNA, Gene.

Er mwyn cynnal yr adwaith cadwyn polymeras Rhaid i'r elfennau canlynol: moleciwl DNA cychwynnol, mae DNA Thermostable polymeras (Taq neu Pfu), ffosffadau deoxyribonucleotide (ffynonellau basau nitrogen), mae'r preimio (2 primer 1 moleciwl DNA) a ei hun system byffer a all gynnal pob adweithiau.

PCR yn cynnwys tri cham: dadnatureiddiad, anelio paent preimio a elongation.

1. dadnatureiddiad. Ar dymheredd o 94-95 gradd Celsius proshodit torri'r bondiau hydrogen rhwng y ddwy gadwyn o DNA, ac o ganlyniad rydym yn cael dau moleciwlau un-sownd.

2. preimio anelio. Ar dymheredd o 50-60 gradd canradd yn digwydd preimio derbyn ar bennau'r molecylau asid niwclëig un-sownd yn ôl y math o cyfatebolrwydd.

3. elongation. Ar dymheredd o 72 gradd yn cael ei merch syntheseiddio sownd moleciwlau asid diocsiriboniwclëig dwbl.

dilyniannu DNA

dulliau ymchwil biolegol moleciwlaidd yn aml yn gofyn am wybodaeth am y dilyniant o niwcleotidau mewn moleciwl o asid diocsiriboniwclëig. I benderfynu ar y cod genetig mewn trefn. Bydd diagnosteg moleciwlaidd yn y dyfodol fod yn seiliedig ar y wybodaeth a gafwyd wrth benderfynu ar y dilyniant dynol.

Mae'r mathau canlynol o ddilyniannu:

• dilyniannu gan y Maxam-Gilbert;
• Sanger dilyniannu;
• pyrosequencing;
• nanoporovoe dilyniannu.